Zellkultur

Inneres eines CO2-Inkubators mit Zellkulturplatten und -flaschen

Als Zellkultur wird die Kultivierung tierischer oder pflanzlicher Zellen in einem Nährmedium außerhalb des Organismus bezeichnet. Zelllinien sind Zellen einer Gewebeart, die sich im Lauf dieser Zellkultur unbegrenzt fortpflanzen können. Es werden sowohl immortalisierte (unsterbliche) Zelllinien als auch primäre Zellen kultiviert (Primärkultur). Als Primärkultur bezeichnet man eine nicht immortalisierte Zellkultur, die direkt aus einem Gewebe gewonnen wurde. Zellkulturen finden breite Verwendung in der biologischen und medizinischen Forschung, Entwicklung und Produktion.

Geschichte

Seit den Anfängen der naturwissenschaftlichen Forschung gab es Bestrebungen, Zellen und Gewebe auch außerhalb eines Organismus' am Leben zu erhalten, um sie so nähergehend untersuchen zu können. Wilhelm Roux gelang es erstmals 1885, embryonale Hühnerzellen für mehrere Tage in einer Salzlösung am Leben zu erhalten und so das grundlegende Prinzip zu demonstrieren. Im Jahr 1913 zeigte Alexis Carrel, dass Zellen auch länger in Zellkultur wachsen können, insofern sie gefüttert und aseptisch gehalten werden.

Die älteste tierische Zelllinie ist vermutlich das Sticker-Sarkom, ein infektiöser Tumor natürlichen Ursprungs, der vor etwa 200 bis 11.000 Jahren entstand.[1][2][3] Seit seiner Entstehung hat das Sticker-Sarkom etwa 1,9 Millionen Mutationen angesammelt, 646 Gene wurden deletiert.[3]

In den Jahren 1951/1952 wurde erstmals eine unsterbliche menschliche Zelllinie aus einem Cervixkarzinom etabliert, welche später unter dem Namen HeLa bekannt wurde. In den folgenden Jahrzehnten wurden insbesondere Nährmedien, Wachstumsfaktoren und Bedingungen weiterentwickelt und neue Zelllinien etabliert. César Milstein und Georges Köhler entdeckten 1975 mit der Hybridom-Technik die Möglichkeit zur Bildung monoklonaler Antikörper durch Zellfusion von Lymphozyten mit Krebszellen. Für diese Entdeckung erhielten sie 1984 den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin. Darüber hinaus wurden in diesen Jahren Methoden zur gezielten Einführung und Expression von Genen in Zellen, die sogenannte Transfektion, entwickelt.[4]

Körperzellen, die noch nicht ausdifferenziert sind – sogenannte Stammzellen, wurden erstmals 1981 aus Blastozysten einer embryonalen Maus isoliert. Sie neigen in vitro dazu, spontan zu differenzieren. Dies kann durch Faktoren unterbunden werden, welche die Selbsterneuerung der Zellen fördern. Mehrere solcher Stoffe wurden seit Ende der 1980er Jahre identifiziert. Die Forschung in diesem Feld konzentriert sich derzeit auf die Kultivierung und gezielte Ausdifferenzierung von sowohl embryonalen als auch adulten Stammzellen.

Prinzip

Die Arbeiten mit Zellen erfolgen meistens in einem Zellkulturlabor. Das Anlegen von Primärkulturen kann aus unterschiedlichen Geweben erfolgen, beispielsweise aus ganzen Embryonen oder einzelnen Organen wie Haut, Niere usw. Das Gewebe wird mit einer Protease, beispielsweise Trypsin, behandelt, die die Proteine abbaut, die den Zellverband aufrechterhalten. Dadurch werden die Zellen vereinzelt. Durch Zugabe von Wachstumsfaktoren können gezielt manche Zelltypen zur Teilung angeregt werden. Bei schlecht wachsenden Zelltypen werden auch Fütterzellen, basalmembranartige Matrices und rekombinante Bestandteile der extrazellulären Matrix verwendet.

Die einem tierischen oder humanen Gewebe entnommenen Tumorzellen werden nach anfänglichem Wachstum auf einem Nährboden durch Analyse von Oberflächenantigenen (Immunzytologie) oder des Genoms (PCR und Sequenzierung) analysiert und ausgewählt, um dann einen großen Tumorzellklon in Kultur zu bringen. Die Zellen können auch durch Einschleusung eines Plasmids als Vektor genetisch verändert werden. Von der Stammkultur (stock) werden Zellen abgenommen und in flüssigem Stickstoff tiefgekühlt und stehen so dem Versand an andere Forschungseinrichtungen zur Verfügung.

Die meisten Zellen besitzen eine eingeschränkte Lebensdauer (begrenzt durch das Hayflick-Limit), mit Ausnahme von einigen von Tumoren abstammenden Zellen. Nach einer bestimmten Anzahl von Verdopplungen gehen diese Zellen in die Seneszenz und teilen sich nicht mehr. Etablierte oder unsterbliche Zelllinien haben die Fähigkeit erlangt, sich unendlich zu teilen – entweder durch zufällige Mutation (in Tumorzellen) oder durch gezielte Veränderung (beispielsweise durch die künstliche Expression des Telomerase-Gens).

Man unterscheidet auch adhärent (auf Oberflächen) wachsende Zellen wie beispielsweise Fibroblasten, Endothelzellen oder Knorpelzellen von Suspensionszellen, die frei im Nährmedium schwimmend wachsen, wie zum Beispiel Lymphozyten. Die Kulturbedingungen unterscheiden sich stark zwischen den einzelnen kultivierten Zelllinien. Die verschiedenen Zelltypen bevorzugen dabei unterschiedliche Nährmedien, die spezifisch zusammengestellt werden, beispielsweise unterschiedliche pH-Werte oder Konzentration an Aminosäuren oder Nährstoffen. In der Regel wachsen Säugerzellen bei 37 °C mit einer Atmosphäre von 5 % CO2 in speziellen Inkubatoren.

Strikt adhärente Zelllinien in kontinuierlicher Kultur hören mit dem Wachstum auf, wenn die gesamte Wachstumsfläche von Zellen bedeckt wurde (Zellkontakthemmung). Außerdem droht ein Absterben der Kultur, wenn die Zelldichte zu hoch ist und damit die Proliferationsrate erheblich sinkt – die Maximaldichte ist erreicht. In diesem Fall löst man die Zellen enzymatisch aus der Wachstumsfläche, verdünnt und überführt sie in neue Kulturgefäße.[5] Dieser Prozess wird als „Passagieren“ bezeichnet (auch „Subkultivieren“, „Passage“ oder „Splitting“ genannt). Je nach Teilungsrate, Dichte und Art der Zellen erfolgt dieser Zeitpunkt unterschiedlich – während 3T3-Zellen namensgebend alle 3 Tage passagiert werden, sollten dies bei stark wachsenden Tumorzelllinien früh in der stationären Phase bzw. vor Erreichen der Konfluenz erfolgen.[5] Die Passagezahl gibt dabei die Häufigkeit an, mit der die Zellen bereits passagiert wurden, sie erhöht sich bei jedem Passagieren um 1.

Nährmedien sind beispielsweise RPMI-1640, Dulbecco’s Modified Eagle Medium oder Ham's F12. Zum Waschen und zur kurzfristigen Lagerung (wenige Minuten) werden Balanced Salt Solutions wie Hanks-Salze oder Earle-Salze verwendet.

Anwendung

Zellkulturen finden besonders in Forschung und Entwicklung breite Anwendung. Der Stoffwechsel, die Teilung und viele weitere zelluläre Prozesse können so in der Grundlagenforschung untersucht werden. Weiterhin werden kultivierte Zellen als Testsysteme eingesetzt, beispielsweise bei der Untersuchung der Wirkung von Substanzen auf die Signaltransduktion und Toxizität der Zelle. Hierbei wird auch die Anzahl von Tierversuchen drastisch reduziert.

Für die Herstellung von etlichen biotechnischen Produkten haben Zellkulturen von Säugerzellen ebenfalls hohe Bedeutung. Beispielsweise werden monoklonale Antikörper für Forschung und therapeutische Anwendung in der Medizin mittels Zellkultur hergestellt. Obwohl einfache Proteine mit weniger Aufwand auch in Bakterien produziert werden können, müssen glykosylierte Proteine in der Zellkultur hergestellt werden, da nur hier die korrekten Glykosylierungen der Proteine erfolgen. Ein Beispiel hierfür ist Erythropoetin (EPO). Auch viele Impfstoffe werden in der Zellkultur hergestellt. Für die Entwicklung und die Realisierung von industriellen Zellkulturprozessen werden Bioreaktoren eingesetzt, teilweise in Insektenzellkultur. Dabei sind für die Herstellung von biopharmazeutischen Produkten Einweg-Bioreaktoren von vermehrtem Interesse.

In der Pflanzenvermehrung erzeugt man bei der Pflanzlichen Gewebekultur aus Zellkulturen komplette Pflanzen.

Zellkultur-Linien

Es ist zu beachten, dass die folgende Auflistung der Zellkultur-Linien unvollständig ist. Alleine die ATCC führt bis zu 4.000 Zelllinien.[6]

ZelllinieBedeutungUrsprungsspeziesUrsprungsgewebeMorphologieLink
293-Tenthält Plasmid mit temperatursensitiver Mutante des Simian-Virus 40 großen T-AntigenMenschNiere (Embryo) Derivat von HEK-293EpithelDSMZ Cellosaurus
A431MenschHautEpithelDSMZ Cellosaurus
A549MenschAdenokarzinom der LungeEpithelDSMZ Cellosaurus
BCP-1MenschBlutLymphozytATCC Cellosaurus
bEnd.3brain endothelialMausGehirn / GroßhirnrindeEndothelATCC Cellosaurus
BHK-21syrian baby hamster kidneyHamsterNiere (embryonal)FibroblastDSMZ Cellosaurus
BxPC-3MenschPankreas, AdenokarzinomEpithelDSMZ Cellosaurus
BY-2Bright Yellow-2TabakAm Keimling induzierter KallusDSMZ (Memento vom 8. November 2007 im Internet Archive)
CHOChinese hamster ovaryHamsterOvarienEpithelICLC Cellosaurus
COS-1Durch Transformation eines origin-defective SV-40 aus CV-1 Zellen hervorgegangenAffe – Chlorocebus aethiops (Äthiopische Grünmeerkatze)NiereFibroblastDSMZ Cellosaurus
COS-7Durch Transformation eines origin-defective SV-40 aus CV-1 Zellen hervorgegangenAffe – Chlorocebus aethiopsNiereFibroblastDSMZ Cellosaurus
CV-1Affe – Chlorocebus aethiopsNiereFibroblastCellosaurus
EPCherpesviral induziertes, papuläres EpitheliomFisch (Pimephales promelas)HautEpithelATCC Cellosaurus
HaCaThuman adult, calcium, temperatureMenschKeratinozytEpithelCellosaurus
HDMEChuman dermal microvascular endothelial cellsMenschVorhautEndothelJournal of Investigative Dermatology[7]
HEK-293human embryonic kidneyMenschNiere (embryonal)EpithelDSMZ Cellosaurus
HeLaHenrietta LacksMenschZervixkarzinom (Gebärmutterhalskrebs)EpithelDSMZ Cellosaurus
HepG2human hepatocellular carcinomaMenschLeberzellkarzinomEpithelDSMZ Cellosaurus
HL-60human leukemiaMenschPromyeloblastenBlutzellenDSMZ Cellosaurus
HMEC-1immortalized human microvascular endothelial cellsMenschVorhautEndothelATCC Cellosaurus
HUVEChuman umbilical vein endothelial cellsMenschNabelschnurveneEndothelICLC
HT-1080MenschFibrosarkomBindegewebszellenDSMZ Cellosaurus
JurkatMenschT-Zell-LeukämieBlutzellenDSMZ Cellosaurus
K562älteste Leukämie-Zelllinie des MenschenMenschBlutmyeloische Blutzellen, etabliert 1975DSMZ Cellosaurus
LNCaPMenschProstata AdenokarzinomEpithelDSMZ Cellosaurus
MCF-7Michigan Cancer FoundationMenschBrust, AdenokarzinomEpithelDSMZ Cellosaurus
MCF-10AMichigan Cancer FoundationMenschBrustdrüseEpithelATCC Cellosaurus
MDCKMadin Darby canine kidneyHundNiereEpithelATCC Cellosaurus
MTD-1AMausBrustdrüseEpithelCellosaurus
MyEndmyocardial endothelialMausHerzEndothelCellosaurus
Neuro-2A (N2A)NeuroblastomMausGehirnNeuroblastDSMZ Cellosaurus
NIH-3T3NIH, 3-day transfer, inoculum 3 × 105 cells, contact-inhibited NIH Swiss mouse embryoMausEmbryoFibroblastDSMZ Cellosaurus
NTERA-2 cl.D1 [NT2/D1]Pluripotente Zelle mit Tretinoin differenzierbarMenschHoden, LungenmetastaseEpithelATCC Cellosaurus
P19Pluripotente Zelle mit Tretinoin differenzierbarMausEmbryonales KarzinomEpithelDSMZ Cellosaurus
PANC-1pancreas 1MenschPankreas, AdenokarzinomEpithelDSMZ Cellosaurus
PeerMenschT cell leukemiaDSMZ Cellosaurus
RTL-W1rainbow-trout liver – Waterloo 1 cellsRegenbogenforelleOncorhynchus mykissLeberFibroblast (wahrscheinlich)Cellosaurus
Sf-9Spodoptera frugiperdaInsekt – Spodoptera frugiperda (Nachtfalter)OvarDSMZ Cellosaurus
Saos-2OsteosarkomMenschKnochenEpithelDSMZ Cellosaurus
T2MenschT cell leukemia /B cell line hybridomaDSMZ Cellosaurus
T84MenschKolorektales Karzinom / LungenmetastaseEpithelATCC Cellosaurus
U-937MenschBurkitt-LymphommonozytärDSMZ Cellosaurus

Siehe auch

Literatur

  • Sabine Schmitz: Der Experimentator: Zellkultur. 1. Auflage. Spektrum Akademischer Verlag, 2007, ISBN 978-3-8274-1564-6.
  • Toni Lindl, Gerhard Gstraunthaler: Zell- und Gewebekultur. Von den Grundlagen zur Laborbank. 6. Auflage. Spektrum Akademischer Verlag, 2008, ISBN 978-3-8274-1776-3.
  • W. W. Minuth, L. Denk: Advanced Culture Experiments with Adherent Cells. – From single cells to specialized tissues in perfusion culture. Open access publishing. Universität Regensburg 2011, ISBN 978-3-88246-330-9.

Einzelnachweise

  1. Claudio Murgia et al.: Clonal origin and evolution of a transmissible cancer. In: Cell. Band 126, Nr. 3, 11. August 2006, S. 477–487, doi:10.1016/j.cell.2006.05.051, PMID 16901782, PMC 2593932 (freier Volltext) – (englisch).
  2. Iain D. O'Neill: Concise review: transmissible animal tumors as models of the cancer stem-cell process. In: Stem Cells (Dayton, Ohio). Band 29, Nr. 12, Dezember 2011, S. 1909–1914, doi:10.1002/stem.751, PMID 21956952 (englisch).
  3. a b Heidi G. Parker, Elaine A. Ostrander: Cancer. Hiding in plain view--an ancient dog in the modern world. In: Science (New York, N.Y.). Band 343, Nr. 6169, 24. Januar 2014, S. 376–378, doi:10.1126/science.1248812, PMID 24458629, PMC 5204361 (freier Volltext) – (englisch).
  4. Bruce Alberts et al.: Table 8-3, Some Landmarks in the Development of Tissue and Cell Culture. 2002, abgerufen am 25. Juli 2022 (englisch).
  5. a b Gerhard Gstraunthaler, Toni Lindl: Subkultivierung / Passagieren. In: Zell- und Gewebekultur: Allgemeine Grundlagen und spezielle Anwendungen. 7. Auflage. Springer, Berlin, Heidelberg 2013, ISBN 978-3-642-35997-2, S. 113, doi:10.1007/978-3-642-35997-2_11.
  6. ATCC Cell Lines. Abgerufen am 6. Februar 2018 (englisch).
  7. Zbigniew Ruszczak et al.: Effects of rIFN alpha, beta, and gamma on the morphology, proliferation, and cell surface antigen expression of human dermal microvascular endothelial cells in vitro. In: The Journal of Investigative Dermatology. Band 95, Nr. 6, Dezember 1990, S. 693–699, doi:10.1111/1523-1747.ep12514496, PMID 1979080 (englisch).

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Binder CB 210 incubator interior.jpg

Interior of a Binder CB 210 CO2 incubator for use in cell culture and tissue culture.
It contains several vessels commonly used in cell culture such as culture flasks, petri dishes, and microtiter plates.

The red liquid in the vessels is cell culture medium such as DMEM containing the pH indicator phenol red.