Taq-Polymerase

Taq-Polymerase I
Vorhandene Strukturdaten: s. UniProt
Masse/Länge Primärstruktur	835 Aminosäuren
Bezeichner
Gen-Name(n)	polA
Externe IDs	UniProt: P19821
Enzymklassifikation
EC, Kategorie	2.7.7.7, Nukleotidyltransferase
Substrat	Desoxyribonucleosidtriphosphat + DNAn
Produkte	Diphosphat + DNAn+1

Die Taq-Polymerase ist die thermostabile DNA-Polymerase des Bakteriums Thermus aquaticus (Taq). Dieses Bakterium lebt in Geysiren bei etwa 70 °C. Taq-Polymerase ist außerordentlich hitzebeständig und gehört zu den Extremozymen. 1969 wurde die Taq-Polymerase erstmals von Thomas D. Brock und Hudson Freeze isoliert.

Eigenschaften

Das Enzym wird hauptsächlich zur DNA-Vervielfältigung mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion eingesetzt. DNA-Polymerasen von mesophilen Organismen würden bei Erhitzung während der Polymerase-Kettenreaktion denaturiert und müssten nach jedem Zyklus neu hinzugegeben werden. Bei der DNA-Vervielfältigung mit Taq-Polymerase ist dies nicht notwendig, da das Enzym auch bei hohen Temperaturen noch sehr stabil ist (die Enzym-Halbwertszeit beträgt bei 97,5 °C ca. 9 Minuten^[1]). Die DNA-Amplifikation mit Taq ist jedoch fehleranfällig, denn das Enzym besitzt keine 3' → 5'-Exonukleaseaktivität und damit keine proof reading-Funktion. Die Fehlerrate der Taq-Polymerase beträgt 8 · 10⁻⁶ Fehler pro Basenpaar.^[2] In den amplifizierten DNA-Fragmenten finden sich deshalb häufig Mutationen, die durch ungenaues Kopieren des Matrizenstranges entstehen. Werden sequenzexakte DNA-Amplifikate benötigt, empfiehlt sich daher der Einsatz von Polymerasen mit proof reading-Funktion, etwa von Pfu-, Pwo-Polymerase oder Pfx-Polymerasen (die ursprünglich ebenfalls aus thermophilen Mikroorganismen isoliert wurden), deren Einsatz jedoch kostenintensiver ist.

Bei der Amplifikation eines DNA-Fragments hängt die Taq-Polymerase ein zusätzliches Nukleotid (dATP) an das 3'-Ende des synthetisierten Strangs. Man spricht von einem 3'-A-Überhang (A für Adenin), da sich auf dem Matrizenstrang keine komplementäre Nukleobase (Thymin) befindet. Der 3'-Überhang wird durch das Fehlen der proof reading-Funktion nicht korrigiert und findet Anwendung beim Verfahren der TA-Klonierung. Durch eine Deletion der ersten 289 Aminosäuren wird das Stoffel-Fragment erzeugt.^[3]

Die Massenproduktion des Enzyms erfolgt durch Übertragung des Gens auf einen Stamm des Bakteriums Escherichia coli. Aus diesen Kulturen wird das Protein gereinigt und in einem glycerolhaltigen Puffer bei −20 °C aufbewahrt.

Einzelnachweise

1. ↑ F. C. Lawyer, S. Stoffel, R. K. Saiki u. a.: High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity. In: PCR Methods Appl. Band 2, Nr. 4, Mai 1993, S. 275–287, PMID 8324500. 
2. ↑ J. Cline, J. C. Braman, H. H. Hogrefe: PCR fidelity of pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases. In: Nucleic Acids Research. (1996), Bd. 24(18), S. 3546–51. PMID 8836181; PMC 146123 (freier Volltext).
3. ↑ S. Dabrowski, J. Kur: Recombinant His-tagged DNA polymerase. II. Cloning and purification of Thermus aquaticus recombinant DNA polymerase (Stoffel fragment). In: Acta biochimica Polonica. Band 45, Nummer 3, 1998, S. 661–667, PMID 9918492.