Tandem Affinity Purification

Schema der Tandem Affinity Purification

Die Tandem Affinity Purification (TAP) beschreibt die Proteinreinigung unter Verwendung zweier verschiedener chromatographischer Aufreinigungsmethoden. Bei einer Verwendung zweier verschiedener Protein-Tags können beispielsweise zwei verschiedene Affinitätschromatographien durchgeführt werden.[1] Im erweiterten Sinne umfasst die Tandem Affinity Purification alle seriellen Aufreinigungsverfahren, die auf der Affinität des aufzureinigenden Materials zur stationären Phase beruhen.[2]

TAP-Tag

Ab dem Jahr 1999 wurden Tandem Affinity Purification Tags für Proteine entwickelt, welche aus zwei verschiedenen, aufeinander folgenden Protein-Tags bestehen.[3][4] Dessen äußeres (N- oder C-terminales) Protein-Tag wird in der ersten Säule nach Entfernung unerwünschter Bestandteile aus dem Zellaufschluss durch die Protease TEV gespalten, wodurch das gewünschte Protein (ohne sein äußeres Protein-Tag), die TEV-Protease und einige restliche Kontaminationen von der Chromatographiesäule eluieren. Die TEV-Protease aus dem Tobacco Etch Virus hat eine längere Erkennungssequenz (Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser) bzw. ENLYFQ(G/S)), um das aufzureinigende Protein nicht an anderen Stellen zu zerschneiden. Meistens wird zur Entfernung der TEV-Protease und restlicher Kontaminationen als zweites, innenliegendes Protein-Tag das CaM-Tag oder ein Biotin-basiertes Tag verwendet, da deren Elutionsbedingungen nicht denaturierend sind und die Bestandteile des Elutionspuffers (EGTA bzw. Biotin) wenig bei einer folgenden Verwendung stören.

Die Wahl des TAP-Tags und das N- oder C-terminale Einfügen wird durch den Erhalt der biologischen Aktivität des Proteins bestimmt, da manche Kombinationen zu einer fehlerhaften Proteinfaltung und somit geminderter Funktion führen können.[5][6] Daher wird der Einfluss der Position des TAP-Tags auf die Funktion des Fusionsproteins experimentell bestimmt.

Nachdem nur wenige Kombinationen hohe Proteinmengen und Ausbeuten der Proteinreinigung erlauben,[7] werden heute vereinzelte Kombinationen eingesetzt, z. B. das SBP-CBP-Tag (InterPlay), das FLAG-HA-Tag, das 3xFLAG-His-Tag, das ProtA-ProtC-Tag, das ProtG-SBP-Tag, das 2xFLAG-ProtA-Tag, das His-2xStrepII-Tag, das SBP-HA-Tag und das SBP-His-Tag.[7]

Anwendungen

Die Tandem Affinity Purification wird unter anderem zur Reduktion der Reinigungsschritte bei der Proteinreinigung eingesetzt. In Kombination mit der Massenspektrometrie oder mit einem Western Blot können Proteine identifiziert und Protein-Protein-Interaktionen längerer Verweildauer nachgewiesen werden.

Literatur

  • Hubert Rehm, Thomas Letzel: Der Experimentator: Proteinbiochemie / Proteomics. 6. Auflage, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 2009. ISBN 978-3-8274-2312-2.

Einzelnachweise

  1. ↑ J. T. Kadonaga, R. Tjian: Affinity purification of sequence-specific DNA binding proteins. In: Proc Natl Acad Sci U S A (1986), Band 83(16), S. 5889–5893. PMID 3461465; PMC 386402 (freier Volltext).
  2. ↑ M. de Frutos, F. E. Regnier: Tandem chromatographic-immunological analyses. In: Anal Chem. (1993), Band 65(1), S. 17A-25A. PMID 8420386.
  3. ↑ G. Rigaut, et al.: A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. In: Nature Biotechnology. 17, Nr. 10, 1999, S. 1030–1032. doi:10.1038/13732. PMID 10504710.
  4. ↑ O. Puig, et al.: The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. In: Methods. 24, Nr. 3, 2001, S. 218–229. doi:10.1006/meth.2001.1183. PMID 11403571.
  5. ↑ O. Puig, F. Caspary, G. Rigaut, B. Rutz, E. Bouveret, E. Bragado-Nilsson, M. Wilm, B. Séraphin: The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. In: Methods (2001), Band 24(3), S. 218–229, PMID 11403571.
  6. ↑ A. C. Gavin, P. Aloy, P. Grandi, R. Krause et al.: Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery. In: Nature (2006), Band 440, S. 631–636, PMID 16429126.
  7. ↑ a b Y. Li: The tandem affinity purification technology: an overview. In: Biotechnol Lett. (2011), Band 33(8), S. 1487–1499, PMID 21424840.

Auf dieser Seite verwendete Medien

Schematic depiction of two affinity purification approaches..jpg
Autor/Urheber: Wang, J., Trowbridge, J.J., Rao, S. and Orkin, S.H., Proteomic studies of stem cells (July 14, 2008), StemBook, ed. The Stem Cell Research Community, StemBook, doi/10.3824/stembook.1.4.1, http://www.stembook.org., Lizenz: CC BY 3.0
A. Tandem affinity chromatography: a protein of interest is first engineered to contain a Protein A (filled in circle) tag, a Tobacco Echo Virus recognition site (TEV, filled in triangle), and a calmodulin binding peptide (CBP) tag (filled in ellipse). Extracts are made from cells expressing the tagged protein, which should contain associated proteins and contaminants. These complexes are bound to an IgG column, and washed to remove majority of contaminants. TEV protease is then used to elute the semi-purified protein complexes which are subsequently absorbed onto a calmodulin column. After further washing, purified protein complexes containing the protein of interest and its associated proteins are eluted by calcium chelation (EGTA) and identified using LC-MS/MS.