T4-DNA-Ligase

T4-DNA-Ligase
Andere Namen

Polydeoxyribonucleotide synthase [ATP], T4 gene 30 product

Masse/Länge Primärstruktur487 Aminosäuren, 55.293 Da
Bezeichner
Externe IDs
Enzymklassifikation
EC, Kategorie6.5.1.1
Orthologe (Mensch)
Entrez1258680
UniProtP00970
Refseq (Protein)NP_049813.1
PubMed-Suche1258680

Die T4-DNA-Ligase ist ein Enzym aus der Gruppe der DNA-Ligasen und wird vom Enterobakterienphagen-T4 gebildet.[1]

Eigenschaften

Die beiden DNA-Doppelstränge werden durch die Ligase kovalent verbunden

Die T4-DNA-Ligase wird in infizierten E. coli zu Beginn des lytischen Zyklus des T4-Phagen gebildet. Sie erzeugt je eine Phosphodiesterbindung zwischen zwei aneinandergrenzenden DNA-Sequenzen in DNA-Doppelsträngen und dient den Bakteriophagen zur DNA-Replikation, Rekombination und zur DNA-Reparatur. Cofaktoren sind zweiwertige Magnesiumionen. Die T4-DNA-Ligase fügt sowohl blunt ends als auch sticky ends doppelsträngiger DNA, RNA und DNA-RNA-Hybriden zusammen, einzelsträngige DNA oder RNA jedoch nur in geringem Umfang.[2] Der Doppelstrang muss dafür mindestens 5 gepaarte Nukleinbasen aufweisen.[3] Eine durch Proteindesign modifizierte T4-DNA-Ligase, die als Fusionsprotein mit NFκB p50 erzeugt wurde, besitzt eine 160-fach erhöhte Enzymaktivität.[4]

Die T4-DNA-Ligase katalysiert die Reaktion:[5]

ATP + (Desoxyribonukleotid)(n)-3'-hydroxyl + 5'-Phospho-(desoxyribonukleotid)(m) (Desoxyribonukleotid)(n+m) + AMP + Diphosphat

Anwendungen

Die T4-DNA-Ligase wird im Zuge einer Klonierung oder einer künstlichen Gensynthese zur Ligation zweier DNA-Doppelstränge aneinander verwendet (mit 1 mM ATP und 10 mM Mg2+). Sticky ends werden dabei etwa zwölfmal schneller ligiert als blunt ends (10 min vs. 2 h). Eine thermostabile DNA-Ligase zur Verwendung in Polymerasekettenreaktions-basierten Methoden ist die Taq-DNA-Ligase aus Thermus aquaticus.

Literatur

  • E. S. Miller, E. Kutter, G. Mosig, F. Arisaka, T. Kunisawa, W. Rüger: Bacteriophage T4 genome. In: Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. Band 67, Nummer 1, März 2003, S. 86–156, table of contents, PMID 12626685, PMC 150520 (freier Volltext).

Weblinks

Einzelnachweise

  1. J. Armstrong, R. S. Brown, A. Tsugita: Primary structure and genetic organization of phage T4 DNA ligase. In: Nucleic acids research. Band 11, Nummer 20, Oktober 1983, S. 7145–7156, PMID 6314278, PMC 326445 (freier Volltext).
  2. H. Kuhn, M. D. Frank-Kamenetskii: Template-independent ligation of single-stranded DNA by T4 DNA ligase. In: The FEBS journal. Band 272, Nummer 23, Dezember 2005, S. 5991–6000, doi:10.1111/j.1742-4658.2005.04954.x, PMID 16302964.
  3. D. R. Horspool, R. J. Coope, R. A. Holt: Efficient assembly of very short oligonucleotides using T4 DNA Ligase. In: BMC research notes. Band 3, November 2010, S. 291, doi:10.1186/1756-0500-3-291, PMID 21062485, PMC 2994885 (freier Volltext).
  4. R. H. Wilson, S. K. Morton, H. Deiderick, M. L. Gerth, H. A. Paul, I. Gerber, A. Patel, A. D. Ellington, S. P. Hunicke-Smith, W. M. Patrick: Engineered DNA ligases with improved activities in vitro. In: Protein engineering, design & selection : PEDS. Band 26, Nummer 7, Juli 2013, S. 471–478, doi:10.1093/protein/gzt024, PMID 23754529.
  5. I. R. Lehman: DNA ligase: structure, mechanism, and function. In: Science. Band 186, Nummer 4166, November 1974, S. 790–797, PMID 4377758.

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