Flp/FRT-System

Das Flp/FRT-System ist eine Methode der Genetik zur Entfernung oder Einfügung von DNA-Sequenzen. Das Flp/FRT-System wird unter anderem in der reversen Genetik und im Kassettenaustauschverfahren zur Erzeugung transgener Organismen verwendet.

Eigenschaften

Das Flp/FRT-System verwendet die Rekombinase Flippase (Flp), um DNA-Sequenzen ortsspezifisch auszutauschen. Die Rekombinase Flp bindet an FRT-Sequenzen und rekombiniert sie, z. B. in einem Chromosom oder einem Plasmid. Die minimale FRT-Sequenz lautet (34 Basenpaare):

5'GAAGTTCCTATTCtctagaaaGtATAGGAACTTC3'

Die Flippase bindet an beide Enden der FRT-Sequenz, die auf beiden DNA-Strängen zueinander palindromisch sind. In der Mitte der FRT-Sequenz liegt ein minimaler Abstandshalter von acht Basenpaaren (tctagaaa). Auf dem Plusstrang erfolgt durch die Flippase eine Hydrolyse der DNA vor dem Abstandshalter, auf dem Minusstrang nach dem Abstandshalter.[1]

Obwohl verschiedene FRT-Sequenzen bekannt sind, funktioniert eine Rekombination nur zwischen zwei gleichen Sequenzen.[2][3] Manche FRT-Sequenzen besitzen in 5'-Richtung eine zusätzliche DNA-Sequenz (5'-GAAGTTCCTATTCC-3') eine Base vor der FRT-Sequenz:

5'GAAGTTCCTATTCcGAAGTTCCTATTCtctagaaaGtATAGGAACTTC3'

Dieses Segment ist nicht notwendig bei der Entfernung einer DNA-Sequenz (bei einer Deletion), jedoch notwendig für eine Insertion, z. B. beim RMCE-Kassettenaustauschverfahren.[4] Die Insertion erfolgt unter Inversion der DNA-Sequenzen. Nach der Rekombination verbleiben Teile der FRT-Sequenzen (englisch FRT-Twins).[5] Die Rekombination kann durch gewebsspezifische Promotoren auf einzelne Organe beschränkt werden. Durch induzierbare Promotoren (z. B. durch Tamoxifen oder Mifepriston) kann der Rekombinationszeitpunkt gesteuert werden, z. B. bei der Expression toxischer Proteine oder bei Letalfaktoren.[6]

Anwendungen

Das Flp/FRT-System wird zur Erzeugung von Mutanten mit Deletionen oder Insertionen verwendet, z. B. beim Gen-Knockout, bei der Mosaikenerzeugung oder bei der Erzeugung transgener embryonaler Stammzellen.[7][8][9] Es wurde unter anderem in Mäusen,[10] Drosophila spp.,[11] der Bäckerhefe[12] und Pflanzen verwendet.[13]

Eine Alternative zum Flp/FRT-System ist das Cre/loxP-System.

Einzelnachweise

  1. ↑ Zhu XD, Sadowski PD: Cleavage-dependent Ligation by the FLP Recombinase. In: Journal of Biological Chemistry. 270, Nr. 39, 1995, S. 23044–54. doi:10.1074/jbc.270.39.23044. PMID 7559444.
  2. ↑ Schlake T, Bode J: Use of mutated FLP recognition target (FRT) sites for the exchange of expression cassettes at defined chromosomal loci. In: Biochemistry. 33, Nr. 43, 1994, S. 12746–12751. doi:10.1021/bi00209a003. PMID 7947678.
  3. ↑ S. Turan, J. Kuehle, A. Schambach, C. Baum, J. Bode: Multiplexing RMCE: Versatile Extensions of the Flp-Recombinase-Mediated Cassette-Exchange Technology. In: J. Mol. Biol.. 402, Nr. 1, 2010, S. 52–69. doi:10.1016/j.jmb.2010.07.015. PMID 20650281.
  4. ↑ S., Bode, J. Turan: Site-specific recombinases: from tag-and-target- to tag-and-exchange-based genomic modifications. In: FASEB J.. 25, 2011, S. 4088–4107. doi:10.1096/fj.11-186940. PMID 21891781.
  5. ↑ S. Turan, C. Zehe, J. Kuehle, J. Qiao, J. Bode: Recombinase-mediated cassette exchange (RMCE) - a rapidly-expanding toolbox for targeted genomic modifications. In: Gene. Band 515, Nummer 1, Februar 2013, S. 1–27, ISSN 1879-0038. doi:10.1016/j.gene.2012.11.016. PMID 23201421.
  6. ↑ D. A. Hutcheson, G. Kardon: Genetic manipulations reveal dynamic cell and gene functions: Cre-ating a new view of myogenesis. In: Cell cycle (Georgetown, Tex.). Band 8, Nummer 22, November 2009, S. 3675–3678, ISSN 1551-4005. PMID 19844163. PMC 2880528 (freier Volltext).
  7. ↑ M. Mishina, K. Sakimura: Conditional gene targeting on the pure C57BL/6 genetic background. In: Neuroscience research. Band 58, Nummer 2, Juni 2007, S. 105–112, ISSN 0168-0102. doi:10.1016/j.neures.2007.01.004. PMID 17298852.
  8. ↑ T. Lee, L. Luo: Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. In: Trends in neurosciences. Band 24, Nummer 5, Mai 2001, S. 251–254, ISSN 0166-2236. PMID 11311363.
  9. ↑ R. Mortensen: Overview of gene targeting by homologous recombination. In: Current protocols in molecular biology / edited by Frederick M. Ausubel ... [et al.]. Chapter 23November 2006, S. Unit 23.1, ISSN 1934-3647. doi:10.1002/0471142727.mb2301s76. PMID 19444792.
  10. ↑ J. E. Belizário, P. Akamini, P. Wolf, B. Strauss, J. Xavier-Neto: New routes for transgenesis of the mouse. In: Journal of applied genetics. Band 53, Nummer 3, August 2012, S. 295–315, ISSN 2190-3883. doi:10.1007/s13353-012-0096-y. PMID 22569888.
  11. ↑ N. A. Theodosiou, T. Xu: Use of FLP/FRT system to study Drosophila development. In: Methods (San Diego, Calif.). Band 14, Nummer 4, April 1998, S. 355–365, ISSN 1046-2023. doi:10.1006/meth.1998.0591. PMID 9608507.
  12. ↑ H. P. Schweizer: Applications of the Saccharomyces cerevisiae Flp-FRT system in bacterial genetics. In: Journal of molecular microbiology and biotechnology. Band 5, Nummer 2, 2003, S. 67–77, ISSN 1464-1801. PMID 12736528.
  13. ↑ H. Luo, A. P. Kausch: Application of FLP/FRT site-specific DNA recombination system in plants. In: Genetic engineering. Band 24, 2002, S. 1–16, ISSN 0196-3716. PMID 12416298.